Почему я, почему сейчас? В то время как в мире сновидения мы способны понимать, что «наши» переживания нелокальны, та часть нас, что принадлежит к общепринятой реальности, все равно может задаваться вопросами: «Почему я?», «Почему сейчас?» «Чем я заслужил эту битву?»

Почему мы болеем Важнейшим методом аюрведы является самопознание. По аюрведическому учению, причины всех наших заболеваний скрываются в ошибочном мышлении и неправильных поступках, в отсутствии взаимопонимания с миром. Любая проблема, проявившаяся на уровне

Почему? Постижение идеи можно сравнить с зачатием ребенка. Люди испытывают идущую из глубины сердца потребность в поисках истины. Подобно тому, как потребность в продолжении рода вынуждает нас иметь детей, потребность в истине побуждает нас создавать идеи. Но если истина

Почему? В начале 634 г. тревожная весть достигла Кесарии, красивого города на побережье Палестины, который долгое время служил столицей прилегающей территории. Большой военный отряд сарацин, вторгшись на римскую территорию, перешел в пустыню Негев и направлялся на север к

Почему родителям нужен буддизм и почему буддистам стоит стать родителями Движимый любовью и сочувствием К тем, кто еще не узнал эту подлинную природу, Я посвящаю свои действия благу других: Пусть все существа достигнут освобождения! Я проявился в человеческом

Вирус гриппа — чемпион мутации
Ежегодно тяжелую форму гриппа переносят от трех до пяти миллионов человек, до 500 тысяч из которых умирают от самого гриппа или его осложнений (по данным ВОЗ ). Прививки от гриппа, конечно, существенно снижают вероятность заболеть. Однако

в отличие от таких болезней, как корь или туберкулез, иммунитет к которым вырабатывается после первого заболевания или прививки и остаётся эффективным в течение всей жизни, гриппом многие болеют практически каждый год.

Эффективность иммунитета определяется тем, насколько успешно иммунная система распознает и обезвреживает источник инфекции — вирус или бактерию. При первом заражении или прививке иммунная система учится вырабатывать антитела — молекулы, которые связываются с вирусными частицами или бактериями и обезвреживают их. Однажды выработав антитела, иммунная система оставляет их «на вооружении» до конца жизни.

Поэтому, если человек заражается той же самой инфекцией повторно, иммунитет срабатывает и инфекция быстро обезвреживается. Именно по такому принципу работают прививки против кори, туберкулёза и других заболеваний. Почему же этот механизм дает сбой с вирусом гриппа и прививаться от гриппа приходится каждый год заново?

Это связано с двумя причинами. Первая — это особенность взаимодействия между нашей иммунной системой и вирусом. Поверхность частиц вируса гриппа покрыта молекулами двух белков, называемых гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA) (см. рисунок). По типу этих белков классифицируются различные варианты гриппа человека, например, H1N1 (гемагглютинин типа 1, нейраминидаза типа 1). Человеческая иммунная система умеет вырабатывать антитела, которые успешно связываются с этими белками. Проблема заключается в том, что эти антитела довольно «привередливы». Даже небольшие изменения в структуре HA и NA приводят к тому, что антитела теряют способность связываться с ними и обезвреживать вирус.

С точки зрения иммунной системы такие модифицированные варианты уже известного вируса выглядят как совершенно новые инфекции.

Во-вторых, на помощь вирусу приходит чрезвычайно полезное для него (и вредное для нас) свойство — способность быстро эволюционировать. Как и все другие организмы, вирус гриппа подвержен случайным мутациям. Это значит, что генетическая информация вирусов-потомков немного отличается от генетической информации вирусов-родителей. Таким образом, мутации постоянно создаются новые варианты белков HA и NA. Однако в отличие от высших живых организмов и от многих других вирусов грипп видоизменяется очень быстро:

чтобы накопить столько же мутаций, сколько белки млекопитающих накапливают за миллионы лет, вирусу гриппа требуется всего несколько лет или даже месяцев.

Таким образом, эволюцию вируса гриппа мы можем наблюдать буквально в реальном времени.

Некоторые из мутаций гриппа приводят к тому, что иммунная система, «натренированная» на старый штамм, распознаёт мутировавший вирус хуже, чем не мутировавший. В то время как иммунитет эффективно борется с немутировашими вирусами, вирусы-мутанты размножаются и заражают всё большее и большее количество людей. Это классический процесс естественного отбора, открытого Чарльзом Дарвином.

Отбор осуществляет иммунная система, которая, защищая нас, невольно оказывает нам медвежью услугу.

Через некоторое время — как правило, два-три года — старый, не мутировавший штамм (вариант вируса) полностью вымирает, а вирус-мутант становится новым доминирующим штаммом. Иммунная система большинства людей учится справляться и с новым штаммом, и цикл повторяется. Такая «гонка вооружений» между вирусом и иммунной системой продолжается десятилетиями.

Как бороться с гриппом

Как в таком случае бороться с гриппом? Есть несколько способов помочь нашей иммунной системе. Во-первых, создаются противовирусные препараты, например, озельтамивир (известный под торговой маркой «Тамифлю») или амантадин, которые препятствуют воспроизводству вируса внутри клеток. К сожалению, вирусы со временем вырабатывают устойчивость к таким препаратам посредством того же процесса мутаций и естественного отбора:

так, почти весь вирус подтипа H1N1, циркулировавший в 2009 году, оказался устойчив к озельтамивиру («Тамифлю»).

Во-вторых, ученые пытаются научить иммунную систему распознавать менее изменчивые части вируса (об этом писала ).

В-третьих, ученые пытаются предсказать, какой штамм вируса окажется наиболее распространенным в следующем году. Если мы научимся это делать, мы сможем «переобучать» нашу иммунную систему по мере необходимости, заранее делая прививку против того штамма, который будет преобладать в следующем сезоне, и наш иммунитет получит фору в гонке вооружений с вирусом. Собственно,

уже сегодня Всемирная организация здравоохранения обновляет состав вакцины от гриппа каждые полгода.

Однако иногда — раз в несколько лет — преобладающим оказывается не тот штамм, на основе которого разрабатывалась вакцина; в таком случае прививка оказывается менее эффективной. Поэтому точное предсказание штамма, который будет наиболее распространён в следующем году, является одной из важных задач борьбы с гриппом.

Наша группа (Джонатан Душофф, Джошуа Плоткин, Георгий Базыкин и Сергей Кряжимский) занимается изучением эволюции вируса гриппа и других организмов уже несколько лет. Наше сотрудничество началось в Принстонском университете в лаборатории профессора Саймона Левина, чьими аспирантами мы были в разные годы. Нас с самого начала интересовали как практические вопросы (как наиболее эффективно предсказать следующий преобладающий штамм), так и фундаментальные вопросы эволюции, например,

является ли эволюция гриппа направленной или случайной.

Задачей нашего последнего совместного проекта было определить взаимосвязь между мутациями, происходящими в разных частях белков HA и NA. Дело в том, что одна и та же мутация, скажем, в белке HA может иметь очень разные последствия для вируса в зависимости от того, произошли ли мутации в других частях того же белка. Например, мутация А позволяет вирусу стать «невидимым» для иммунной системы только в паре с мутацией Б, в то время как каждая из мутаций сама по себе для вируса бесполезна. Обнаружить такие пары мутаций, называемых эпистатическими, можно, проанализировав статистические закономерности в генетических последовательностях вируса. Это мы и сделали .

Такой анализ стал возможен лишь в последние годы, когда резко упала стоимость «секвенирования», то есть выяснения генетических последовательностей.

Количество генетических последовательностей вируса гриппа, зарегистрированных в базе данных , за последние пять лет выросло более чем в шесть раз и достигает 150 тысяч. Такого количества данных достаточно, чтобы обнаружить эпистатические пары мутаций, которые произошли в вирусе гриппа за последние 100 лет.

Оказывается, количество эпистатических мутаций в гриппе достаточно велико, то есть избежать атаки иммунной системы или обрести невосприимчивость к антивирусному препарату могут, по всей видимости, лишь весьма специфические варианты вируса, которые обзаводятся необходимыми комбинациями мутаций. Например, невосприимчивость к препарату озельтамивир появилась в 2009-м году только у вирусов, обладающих как минимум тремя специфическими мутациями в белке NA.

С практической точки зрения тот факт, что мутации в вирусе гриппа эпистатические, позволяет надеяться, что в ближайшем будущем мы научимся предсказывать последующие мутации по предыдущим. Пока вирус «собирает» все необходимые мутации для успешной комбинации, мы сможем разработать новую вакцину против штамма, обладающего всей комбинацией, который распространится только через несколько месяцев или даже лет.

Чтобы определить успех той или иной мутации в сочетании с другими, необходимо понять, как именно происходит взаимодействие между мутациями

и как они, совместно и по отдельности, влияют на структуру белков HA и NA, а также разобраться, как иммунная система реагирует на модифицированные варианты этих белков. Эти вопросы сейчас активно исследуются, в особенности в группе Джошуа Плоткина в Университете Пенсильвании, с которой мы активно сотрудничаем, а также другими коллективами.

Введение

Повышение сохранности и продуктивности сельскохозяйственных животных невозможно без дальнейшего совершенствования ветеринарного обслуживания животноводства. Среди ветеринарных дисциплин важное место принадлежит вирусологии. Современный ветеринарный врач должен знать не только клинико - патологическую сторону болезни, но и иметь четкое представление о вирусах, их свойствах, методах лабораторной диагностики и особенностях постинфекционного и поствакцинального иммунитета.

Вирусы изменяют свой свойства как в естественных условиях размножения, так и в эксперименте. В основе наследственного изменение свойств вирусов могут лежать два процесса: 1) мутация, т. е. изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке генома вируса, ведущее к фенотипически выраженному изменению свойства; 2) рекомбинация, т. е. обмен генетическим материалом между двумя близкими, но отличающимися по наследственным свойствам вирусами.

Мутация у вирусов

Мутация - изменчивость, связанная с изменением самих генов. Она может иметь прерывистый, скачкообразный характер и приводить к стойким изменением наследственных свойств вирусов. Все мутации вирусов делятся на две группы:

· спонтанные;

· индуцированные;

По протяженности их делят на точечные и аберрационные (изменения, затрагивающие значительный участок генома). Точечные мутации обусловлены заменой одного нуклеотида (для РНК-содержащих вирусов). Такие мутации могут иногда ревертировать с восстановлением исходной структуры генома.

Однако мутационные изменения способны захватывать и более крупные участки молекул нуклеиновых кислот, т. е. несколько нуклеотидов. В этом случае тоже могут происходить выпадения, вставки и перемещения (транслокация) целых участков и даже повороты участков на 180° (так называемые инверсии), смещения рамки считывания - более крупные перестройки в структуре нуклеиновых кислот, а следовательно, и нарушения генетической информации.

Но не всегда точечные мутации приводят к изменению фенотипа. Имеется ряд причин, в силу которых такие мутации могут не проявляться. Одна из них - вырожденность генетического кода. Код белкового синтеза вырожден, т. е. некоторые аминокислоты могут кодироваться несколькими триплетами (кодонами). Например, аминокислота лейцин может кодироваться шестью триплетами. Вот почему, если в молекуле РНК вследствие каких-то воздействий произошла замена триплета ЦУУ на ЦУЦ, ЦУА на ЦУГ, то в молекуле синтезируемого белка все равно включится аминокислота лейцин. Поэтому ни структура белка, ни его биологические свойства не нарушатся.

Природа пользуется своеобразным языком синонимов и, заменяя один кодон другим, вкладывает в них одно и тоже понятие (аминокислоту), сохраняя, таким образом, в синтезируемом белке его естественную структуру и функцию.

Другое дело, когда какая-то аминокислота кодируется всего одним триплетом, например, синтез триптофана кодируется только одним триплетом УГГ и замены, т. е. синонима, не имеется. В этом случае в белок включается какая-нибудь иная аминокислота, что может привести к появлению мутантного признака.

Аберрация у фагов обусловлена делециями (выпадением) различного числа нуклеотидов, от одной пары до последовательности, которая обуславливает одну или несколько функций вируса. Как спонтанные, так и индуцированные мутации делят также на прямые и обратные.

Мутации могут иметь разные последствия. В одних случаях они ведут к изменению фенотипических проявлений в нормальных условиях. Например, увеличивается или уменьшается размер бляшек под агаровым покрытием; увеличивается или ослабляется нейровирулентность для определенного вида животных; вирус становится более чувствительным к действию химиотерапевтического агента и т. п.

В других случаев мутация является летальной, так как вследствие ее нарушается синтез или функция жизненно важного вирусспецифического белка, например вирусной полимеразы.

В некоторых случаях мутации являются условно летальными, так как вирусспецифический белок сохраняет свои функции в определенных для него условиях и теряет эту способность в неразрешающих (непермиссивных) условиях. Типичным примером таких мутаций являются температурно-чувствительные - ts-мутации, при которых вирус теряет способность размножаться при повышенных температурах (39 - 42°С), сохраняя эту способность при обычных температурах выращивания (36 - 37°С).

Морфологические или структурные мутации могут касаться размера вириона, первичной структуры вирусных белков, изменения генов, детерминирующих ранние и поздние вирусспецифические ферменты, обеспечивающие репродукцию вируса.

По своему механизму мутации могут быть тоже разными. В одних случаях происходит делеция, т. е. выпадение одного или нескольких нуклеотидов, в других - происходит встраивание одного или нескольких нуклеотидов, а в некоторых случаях - замена одного нуклеотида другим.

Мутации могут быть прямыми и обратными. Прямые мутации меняют фенотип, а обратные (реверсии) - его восстанавливают. Возможны истинные реверсии, когда обратная мутация происходит вместе первичного повреждения, и псевдореверсии, если мутация происходит в другом участке дефектного гена (интрагенная супрессия мутации) или в другом гене (экстрагенная супрессия мутации). Реверсия не является редким событием, так как ревертанты обычно более приспособлены к данной клеточной системе. Поэтому при получении мутантов с заданными свойствами, например вакцинных штаммов, приходится считаться с возможной их реверсией к дикому типу.

Вирусы отличаются от остальных представителей живого мира не только своими малыми размерами, избирательной способностью размножаться в живых клетках, особенностями строения наследственного вещества, но и значительной изменчивостью. Изменения могут касаться величины, формы, патогенности, антигенной структуры, тканевого тропизма, устойчивости к физико - химическим воздействиям и других свойств вирусов. Значение причин, механизмов и характера изменения имеет большое значение при получении необходимых вакцинных штаммов вирусов, а также для разработки эффективных мер борьбы с вирусными эпизоотиями, в процессе которых, как известно, свойства вирусов могут существенно изменят одной из причин сравнительно высокой способности вирусов изменять свои свойства является то, что наследственное вещество этих микроорганизмов менее защищено от воздействия внешней среды.

Мутация вирусов может возникать в результате химических изменений цистронов или нарушения последовательности их расположения в структуре молекулы вирусной нуклеиновой кислоты.

В зависимости от условий различают естественную изменчивость вирусов, наблюдаемую в обычных условиях размножения, и искусственную, получаемую в процессе многочисленных специальных пассажей или путем воздействия на вирусы особых физических или химических факторов (мутагенов).

В естественных условиях изменчивость проявляется не у всех вирусов одинаково. Наиболее ярко этот признак выражен у вируса гриппа. Значительной изменчивости подвержен вирус ящера. Об этом свидетельствует наличие большого количества вариантов у разных типов этих вирусов, и существенные изменения его антигенных свойств в конце почти каждой эпизоотии.

Наследственность - это свойство организмов обеспечивать материальную и функциональную преемственность между поколениями, а также обусловливать специфический характер индивидуального развития.

Изменчивость - свойство, противоположное наследственности. Изменчивость вирусов обусловлена мутацией генов, сочетанием их при рекомбинации и различным проявлением признаков, зависящим от внешних условий (модификационная изменчивость).

Генетические признаки (маркеры) вирусов . Все признаки вирусов, информация о которых закодирована в генах, называются генетическими. При этом многие признаки обычно обусловливаются несколькими генами.

Генетические признаки (маркеры) у штаммов определяют после предварительного их клонирования. Все их условно разделяют на основные группы:

• групповые и видовые: тип и морфология нуклеиновой кислоты; тип капсида и количество капсомеров; антигенная специфичность; устойчивость к органическим растворителям и детергентам; наличие фермента нейраминидазы и антигенов хозяина; гемагглютинирующие свойства; патогенность для определенного вида живых чувствительных систем;
• внутриштаммовые: гемагглютинирующая активность; терморезистентность; отношение к УФ-лучам, ингибиторам; характер бляшек и др.

Для проведения генетических исследований наибольшее значение имеют внутривидовые признаки, позволяющие дифференцировать варианты (мутанты, рекомбинанты) между собой.

В большинстве исследований генетические признаки обозначаются начальными буквами латинского алфавита с добавлением знака «+» или «-», т. е. наличие или отсутствие того или иного свойства. Отдельные признаки, например нейровирулентность (N), обозначаются двумя буквами в зависимости от вида животного, на котором проявляется это свойство: нейровирулентность для обезьяны - monN, нейровирулентность для мышей - mN и т. п.

Пока еще трудно унифицировать номенклатуру генетических признаков, поэтому для каждой группы вирусов оправдана специфическая символика их. Однако ряд признаков уже может иметь общие обозначения для всех видов вирусов.

Виды мутации вирусов . Вирусы изменяют свои свойства как в естественных условиях при репродукции, так и в эксперименте. В основе наследственных изменений свойств вирусов лежат два процесса:

• мутация - изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке генома вируса, ведущее к изменению фенотипических свойства;
• рекомбинация - обмен генетическим материалом между двумя близкими, но отличающимися по наследственным свойствам вирусами.

Классификация мутаций .

По механизму :

1. деления - выпадение одного или нескольких нуклеотидов;
2. встраивание одного или нескольких нуклеотидов;
3. замена одного нуклеотида другим.

По длине измененной последовательности нуклеотидов :

1) точечная замена одного нуклеотида (PHK-содержащие вирусы) или одной пары комплементарных нуклеотидов (ДНК-содержащие вирусы). Такие мутации могут иногда восстанавливаться (ревертировать) до исходной структуры генома. Не всегда точечные мутации приводят к изменению фенотипа. Одна из основных причин, в силу которых такие мутации могут не проявляться, - это вырожденность генетического кода, т. е. кодирование одной аминокислоты несколькими триплетами. Поэтому структура белка и его биологические свойства не нарушатся. Если аминокислота кодируется только одним триплетом, то в этом случае в белок включается какая-нибудь иная аминокислота, что может привести к появлению мутантного признака;

2) аберрация - замена значительного участка генома. Аберрации у вирусов обусловлены делециями различного числа нуклеотидов: от одной пары до последовательности, которая детерминирует одну или несколько функций вируса.

По обратимости :

1) необратимые (прямые) мутации, при которых изменяется фенотип. Частота таких мутаций у вирусов колеблется в широких пределах. Это зависит от клеточной системы, в которой происходит развитие вирусной популяции. Одновременно клеточная система может являться и фактором селекции. Мутанты, возникающие в популяции, не остаются генетически чистыми линиями, а иногда могут быстро размножаться и практически полностью вытеснить остальные составляющие популяции;

2) обратимые мутации:

истинные реверсии, при которых обратная мутация происходит в месте первичного повреждения; псевдореверсии, при которых мутация происходит в другом участке дефектного гена (интрагенная супрессия мутации) или в другом гене (экстрагенная супрессия мутации). Реверсии не являются редкими событиями, так как измененные организмы обычно более приспособлены к данной клеточной системе.

По природе :

1) спонтанные мутации, которые в живой природе возникают чрезвычайно редко и под влиянием причин, трудно устанавливаемых в каждом отдельном случае. Такие изменения в популяции вирусов возникают без внешнего воздействия. Однородных популяций не бывает, поэтому в вирусной популяции в процессе ее развития спонтанные мутанты возникают с определенной вероятностью. Частота мутаций одного и того же признака может быть различной в зависимости от штамма.

Возникать спонтанные мутации могут в результате (по Уотсону и Крику, 1953):

а) таутомерного превращения (перегруппировок) оснований, входящих в состав нуклеиновой кислоты. Например, таутомерный сдвиг в положении атома водорода у аденина приводит к тому, что аденин при репликации спаривается не с тимином, а с гуанином. При спаривании оснований ошибка приводит в последующих репликациях к замене пары АТ и ГЦ.

Спонтанные мутации, возникшие в одном и том же гене, распределяются по его длине неравномерно. Одни участки гена изменяются часто («горячие» точки), другие - редко. Поэтому вероятность ошибок при спаривании оснований в различных участках гена различна. Это может быть связано с определенной конформацией нуклеиновой кислоты: отдельные нуклеотиды могут с большей степенью вероятности подвергаться таутомерному превращению, чем другие;

б) ошибок в работе ферментов: ДНК- или РНК-полимераз.

Примеры спонтанных мутаций .

1. Природная изменчивость антигенной структуры (гемагглютинина и нейраминидазы) вирусов гриппа человека и животных (в том числе птиц), на примере штаммов типа А2. Исходные штаммы типа А2 не различались между собой по антигенной структуре, тем, агглютинирующей активности, термостабильности, способности репродукции при 40°С и переходу и индикаторное состояние. (Индикаторный вирус - вирус, позволяющий выявить в культуре клеток другой нецитопатогенный вирус.) Позже штаммы, относящиеся к антигенным подгруппам А2/1, А2/2 и А2/3 (выделенные с 1968 по 1970 г.), показали изменение антигенной структуры и других биологических свойств этого возбудителя. Вначале исчезли ингибиторорезистентные штаммы, а затем ингибиторорезистентные варианты из смешанной популяции чувствительных к ингибиторам штаммов.

2. Гемагтлютинин и нейраминидаза вируса гриппа претерпевают изменения, независимые друг от друга. Например, вирус гриппа птиц, выделенный от индеек в штате Висконсин (США), содержал нейраминидазу, антигенно родственную нейраминидазе вирусов гриппа человека А2/Гонконг/68 и не схожий гемагглютинин, тогда как вирус гриппа, выделенный от свиньи на о. Тайвань, содержал антигены гемагглютинина и нейраминидазы, родственные антигенам вируса гриппа человека А2/Гонконг/68.

3. Известно 11 серовариантов вируса ящура (сем. пикорнавирусы) у типа О, 32 сероварианта у типа А, 5 - у типа С, 7 - у типа Sat-1 и по 3 - у типов Sat-2 и Sat-3. Штаммы вируса ящура типа Азия 1 также неоднородны по антигенной структуре.

4. Повышение или ослабление вирулентности возбудителя Изменения могут происходить в короткие сроки, поскольку жизненный цикл вирусов несравненно короче жизненного цикла хозяев. Известно наличие большого числа патогенных вариантов штаммов вируса болезни Ньюкасла (парамиксовирусы). При первом появлении болезнь в Европе протекала остро, с высоким процентом гибели птиц. В настоящее время все чаще регистрируются очаги с низкой летальностью и легким течением болезни. Происходит не только снижение количества очагов, но и аттенуация эпизоотических штаммов, что позволило выделить природно-ослабленные вакцинные штаммы B1, La Sota, F Бор/74/ВГНКИ.

5. Имеются сообщения о выделении природно-ослабленных штаммов вирусов чумы свиней (штамм Мияги), болезни Ауески (штамм Русс), миксомы кроликов и клещевого энцефалита:

2) индуцированные мутации, которые возникают при действии на вирус (вирион или вегетативную форму) различными химическими и физическими мутагенами, а также при адаптации вируса к необычным биологическим системам (адаптационная изменчивость).

После определения наследственных единиц вируса возникла перспектива получения живых вакцинных штаммов непосредственным воздействием на них физическими или химическими мутагенами, вызывающими структурные и функциональные изменения в молекуле вирусной кислоты. Применение искусственных мутагенов имеет два преимущества:

• они вызывают мутации в десятки и сотни раз эффективнее природных факторов;
• действие искусственных мутагенов имеет известную направленность; можно заранее предвидеть, на какие элементы структуры нуклеиновых кислот и каким образом действует тот или иной мутаген и какие изменения в них вызовет.

Химические мутагены . По классификации Фриза (1960) химические мутагены разделяют на две основные группы:

1. мутагены, реагирующие с нуклеиновой кислотой только во время ее репликации (аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований);
2. мутагены, реагирующие с покоящейся молекулой нуклеиновой кислоты. Однако для формирования мутаций необходимы последующие репликации молекулы (азотистая кислота, гидроксиламин, алкилирующие соединения).

Молекулярные механизмы мутагенного действия химических соединений подразделяются на две основные группы (по Е. Фризу):

1) замена основания, которая бывает двух типов: а) простая (транзиция), когда на место одного пуринового основания встает другое (например, вместо аденина - гуанин) или одно пиримидиновое основание заменяется другим (цитозин - урацилом). Такие замены происходят при индукции мутаций азотистой кислотой, рядом алкилирующих соединений и гидроксиламином;

б) сложная (трансверсия), при которой вместо одного пуринового основания появляется пиримидиновое или пиримидиновое основание заменяется пуриновым. Трансверсии происходят при индукции мутаций этилэтансульфонатом;

2) выпадение (делеция) или вставка основания, которое ведет к более глубоким изменениям генетического кода, чем простая замена оснований. Мутационные повреждения в одном участке генома нередко приводят к изменению нескольких генетических признаков, имеющих различное фенотипическое проявление (плейотропия). В то же время основой изменения генетического признака, имеющего одно и то же фенотипическое выражение (например, способность размножаться при повышенной температуре), могут быть мутационные повреждения различных генов.

Мутагенное действие аналогов азотистых оснований (5-бромурацил, 5-фторурацил, 5-йодурацил, 2-аминопурин, 2,6-ди-аминопурин) заключается в том, что они индуцируют мутации только при воздействии на реплицирующиеся молекулы ДНК и РНК. Наиболее хорошо изучены 5-бромурацил и 2- аминопурин. Тимин является урацилом, у которого атом водорода (Н) в одной из СН-групп заменен метальной группой (СН 3) - метилурацил. Однако в урациле этот атом водорода можно заменить и другим атомом, например атомом брома (Br). В результате такой замены получается новое соединение - бромурацил, который является аналогом тимина. Структура основного кольца у обоих соединений совершенно одинакова, а различие заключается лишь в одной группе (Br вместо СН 3).

Мутации, индуцируемые алкилирующими соединениями , проявляются простыми (транзиция) и сложными (транверсия) заменами в молекуле нуклеиновой кислоты. Из ДНК удаляются пурины (в основном гуанин), и в зависимости от того, какой нуклеотид встретится напротив бреши при репликации, либо возникает мутация типа замены, либо не возникает ее совсем. К данной группе веществ относятся алкилирующие соединения - иприт и его аналоги, этиленимин и его аналоги - этилметансульфонат и этилэтансульфонат и др. Этилметансульфонат и этилэтансульфонат вызывают алкилирование гуанина и в меньшей степени аденина. Это приводит к гидролизу связи между пуриновым основанием и сахаром и утрате пуринового основания. Мутагенное действие этих соединений было показано с вирусами болезни Ньюкасла и клещевого энцефалита.

Мутагенное действие гидроксиламина заключается в образовании простых замен оснований в молекуле нуклеиновой кислоты (направление зависит от типа нуклеиновой кислоты вируса). У ДНК-содержащих вирусов этот мутаген реагирует исключительно с цитозином. У РНК-содержащих вирусов он вступает в реакцию как с цитозином, так и с урацилом, что обусловливает замены цитозина на урацил и наоборот.

С помощью гидроксиламина были индуцированы мутации у вирусов герпеса, болезни Ньюкасла, полиомиелита. Спонтанные мутанты вируса обычного герпеса (по признаку чувствительности к ингибиторам агара) не способны ревертировать под действием гидроксиламина и, следовательно, обусловлены заменой ГЦ на АТ.

Синтезирован и изучен один из аналогов гидроксиламина - оксиметилгидроксиламин, реагирующий только с цитозином, но не с урацилом РНК, т. е. обладающий более высокой специфичностью и одной направленностью мутагенного действия.

К веществам, химически изменяющим основания в покоящейся молекуле нуклеиновой кислоты, относится также гидразин, который действует только на пиримидиновые основания.

Мутагенное действие интерколирующих агентов заключается в способности соединений встраиваться между витками молекулы ДНК - явление интерколяции. При внедрении акридина между основаниями ДНК изменяется расстояние между ними на 0,34-0,7 нм. Мутагенное действие акридина изучено главным образом на бактериофагах.

У вирусов человека и животных с помощью профлавина индуцированы различные типы мутаций при воздействии на внутриклеточный вирус полиомиелита, клещевого энцефалита и оспы коров. В сочетании с видимым светом красители акридинового ряда обладают выраженным летальным действием на ДНК-содержащие вирусы.

Мутагенным действием обладают нитрозосоединения (N-нитрозометилмочевина, N-нитрозоэтилмочевина, 14-метил-М-1-нитpo-N-нитрозогуанидин) и их производные. При щелочном pH мутагенный эффект нитрозосоединений обусловлен образующимся диазотметаном, а при кислом pH - азотистой кислотой.

Для вирусов человека и животных мутагеном является и формальдегид; были индуцированы мутанты у вируса полиомиелита и вируса западного энцефаломиелита лошадей при воздействии соответственно на очищенную РНК и внутриклеточный вирус. Механизм мутагенного действия формальдегида недостаточно изучен.

Мутагенное действие азотистой кислоты заключается в изменении оснований в покоящейся молекуле нуклеиновой кислоты. Наиболее хорошо изучены азотистая кислота (HNO 2) и гидроксиламин. Азотистая кислота как мутаген дезаминирует органические основания [отщепляет молекулы аминогруппы (NH 2)].

В результате действия азотистой кислоты аденин (А) превращается в гипоксантин (Гк), гуанин (Г) - в ксантин (К), а цитозин (Ц) - в урацил (У). У дезаминированных органических оснований возникают новые свойства.

Физические мутагены . Мутагенное действие повышенной температуры (40-50 °С) обнаружили Е. Фриз на опыте с бактериофагом Т4 и Ю. 3. Гендон при обработке РНК вируса полиомиелита. Температура способствует удалению пуринов (апуринизация, преимущественно гуанина) из ДНК.

При репликации такой ДНК напротив бреши, вызванной утратой пурина, в синтезирующуюся цепь могут быть включены любые нуклеотиды. Если включится основание, которого на этом месте ранее не было, то это означает появление мутации (транзиции или трансверсии).

Мутагенное действие ультрафиолетового излучения . Ультрафиолетовые лучи (УФ) взаимодействуют с молекулами нуклеиновых кислот и «поглощаются» органическими основаниями, особенно при длине волны 260-280 нм. Тимин (Т), урацил (У) и цитозин (Ц) более чувствительны к УФ, чем аденин (А) и гуанин (Г). При облучении структура указанных пиримидинов изменяется; две соседние молекулы тиминов соединяются друг с другом в пары, образуя так называемые тиминовые димеры.

Впервые мутагенное действие УФ-лучей на бактериофаги установили американский ученый Кригер (1958), затем Эльмер и Каплан (1959).

Примеры: мутацию у внеклеточного фага Сд получил А. С. Кривинский, используя метод УФ-воздействия на внутриклеточный вирус, удалось получить мутанты вируса болезни Ньюкасла, отличающиеся от исходного штамма по репродукции в культуре клеток.

Под влиянием УФ-лучей получен мелкобляшечный мутант вируса западного лошадиного энцефаломиелита (WEE), обладающий стабильным S-фенотипом в культуре клеток ФКЭ. Установлена возможность получения мутаций при воздействии УФ-лучей на репродуцирующийся вирус и его нуклеиновую кислоту, в которой происходят структурные нарушения РНК: урацил образует лимеры и гидраты.

Факторов, влияющих на эффективность и направленность мутагенеза, по крайней мере восемь:

1) природа мутагена;

2) специфические особенности вируса. В одинаковых экспериментальных условиях один и тот же мутаген может неодинаково индуцировать мутации у разных вирусов и даже штаммов одного и того же вируса;

3) период взаимодействия вируса с клеткой. Мутации могут возникать при воздействии мутагенами на покоящуюся и вегетативную формы вируса. Во втором случае мутагенный эффект связан не только с возможностью проникновения мутагена в клетку, но и с возможностью возникновения неразрывной связи с репликацией вирусного генома.

На разных этапах репродукции различна чувствительность генетического материала вируса к действию мутагенов, что особенно ярко проявляется у РНК-содержащих вирусов с односпиральным геномом. Например, этиленимин впервые успешно применили для индукции мутаций у вирусов позвоночных при воздействии на репродуцирующуюся популяцию вируса клещевого энцефалита.

Была установлена зависимость летального и мутагенного действий вещества от стадии репродукции вируса: наибольший мутагенный и летальный эффект наблюдали при воздействии этим мутагеном в первые 2 ч латентного периода, т. е. в начальной стадии образования репликативных форм;

4) число репликаций, происходящих у вируса после воздействия на него мутагеном;

5) избирательность взаимодействия мутагена с генами вируса. Эффективность и специфичность действия мутагенов зависят от концентрации мутагена, pH, солевого состава среды и ряда других факторов. Для многих мутагенов обнаружена прямая зависимость между интенсивностью мутагенеза и дозой. Однако с увеличением дозы и усилением мутагенного эффекта снижается и выживаемость вируса. Существует математическая зависимость между величиной, определяющей частоту мутаций, и выживаемостью последнего;

6) условия обработки (pH среды, ее состав, температура);

7) тип клеточной системы;

8) условия культивирования. Индуцированный мутагенез зависит от состава питательной среды, в которой находится система «вирус - клетка». При отсутствии в среде роста тимина происходит более интенсивное включение 5-бромурацила в нуклеиновую кислоту.

Воздействие перечисленных мутагенных факторов на нативный (исходный) вирус менее эффективно, что обусловлено:

• меньшей доступностью вирусной нуклеиновой кислоты воздействию мутагенов, неспособных проникать через белковую оболочку вируса;
• определенным стабилизирующим действием вирусного белка, имеющего тесные внутренние связи с нуклеиновой кислотой.

Стабильность мутантов . Не все мутации, образующиеся под влиянием мутагенов, одинаково стабильны. Различия в стабильности связаны с неодинаковым молекулярным механизмом действий использованных мутагенов. Мутанты, полученные при действии повышенной температуры, кислой среды, УФ-лучей и ультразвуковых волн, дают около 20 % реверсий. Это связано с тем, что они вызывают главным образом локальные изменения вирусной нуклеиновой кислоты, ведущие к замене отдельных оснований. При воздействии профлавина все мутанты оказались полностью стабильными. Причиной мутаций являются выпадения или вставки оснований. При получении вакцинных вирусных штаммов путем воздействия на вирус мутагенами целесообразно использовать мутагены, вызывающие более глубокие изменения генетического кода - типа выпадений или вставок, так как такие мутанты обладают стабильностью наследственных свойств.

Мутации, возникающие при пассажах (адаптации) вирусов . Мутантные популяции вирусов могут возникать и в результате адаптации их к биологическим системам in vitro (культуры клеток) и in vivo (животные, куриные эмбрионы).

Мутации при пассажах на животных . При адаптации вирусов к естественно восприимчивым животным или к гетерогенным тканям экспериментально-восприимчивых животных решающее значение в работе имеют многие факторы:

• свойства вируса и способ его введения. Немалое значение имеют и свойства штамма. Например, разные штаммы вируса уличного бешенства требуют различного числа пассажей для превращения их в штамм фиксированного вируса;
• вид и возраст животного. Значение имеет ослабление резистентности хозяев (воздействие кортизоном, температурой, γ-облучением и т. п.).

Существует много примеров влияния используемого при пассажах вида животного на изменение биологических свойств вируса.

Примеры , которые имели положительный исход в виде получения генетически стабильных безвредных живых вакцин:

1) путем серийных пассажей вируса бешенства (штамм Флюри) через мозг однодневных цыплят и далее в куриных эмбрионах (заражение в желточный мешок) получили вакцинный штамм (virus fixe), который апатогенен для кроликов, мышей и собак (варианты Нер и Lep);

2) многократными пассажами вируса желтой лихорадки через мозг мышей значительно усилились нейротропные свойства вируса для мышей и утратились свойства патогенности для обезьян. После 258-260 пассажей адаптированный вирус с 1939 г. применяют для иммунизации людей против этой инфекции;

3) длительные пассажи вируса чумы крупного рогатого скота через организм коз привели к ослаблению его вирулентности для восприимчивых животных. В 1948 г. был получен аттенуированный вариант вируса, применяемый для вакцинации крупного рогатого скота (штамм Эдварде);

4) аналогичным образом Накамура и Миямато адаптировали к кролику вирус чумы крупного рогатого скота (штамм L), который применяют в качестве высокоэффективной живой вакцины;

5) пассажами на мышах и морских свинках удалось преобразовать висцеротропную природу вируса чумы лошадей в нейротропную и получить безвредные для лошадей вакцинные штаммы;

6) длительные пассажи вируса ящура через организм новорожденных кроликов или мышей привели со временем к аттенуации вируса в отношении крупного рогатого скота. Типовая принадлежность при этом не менялась;

7) в результате серии пассажей вируса гриппа (наиболее изменчивый как в экспериментальных, так и в естественных условиях) на мышах (интраназальное введение), он приобрел высокую патогенность для этих животных и вместе с тем утратил патогенность для человека. У адаптированных к мышам штаммов изменился и ряд других свойств: ингибиторочувствительность, терморезистентность и др. Это свидетельствует о глубоких изменениях наследственности вируса.

Мутации при пассажах на куриных эмбрионах . Наследственная изменчивость вирусов наблюдалась и при пассажах их на куриных эмбрионах. Были получены вакцинные штаммы для профилактики инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита птиц, чумы собак, катаральной лихорадки овец (блютанга), чумы крупного рогатого скота, болезни Ньюкасла и др.

Мутации при пассажах в культурах клеток . В культурах клеток и тканей успешно выращиваются и аттенуируются многие вирусы:

• после длительных пассажей в культуре переживающей ткани куриных эмбрионов вирус желтой лихорадки утратил нейротропные и висцеротропные свойства, сохранив иммуногенность. Полученный штамм 17Д успешно используют в качестве живой вакцины;
• получили ряд аттенуированных штаммов вируса полиомиелита (трех типов) путем пассажа в культуре клеток почки обезьян. Вакцина, приготовленная из этих штаммов, безвредна для людей, вызывает напряженный и длительный иммунитет, обеспечивающий невосприимчивость к циркулирующим в природе диким штаммам вируса полиомиелита;
• методом пассажа в сочетании с селекцией в культуре клеток вируса чумы крупного рогатого скота (штамм LIII Накамура) получили аттенуированный ареактогеиный вакцинный штамм ЛТ.

Много сообщений о получении наследственно ослабленных иммуногенных штаммов вируса ящура, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, миксоматоза кроликов и парагриппа-3 крупного рогатого скота при адаптации к различным видам культур клеток.

Причины возникновения мутаций в процессе адаптации . Изменение свойств вируса в процессе пассажей происходит ступенчато. В первых пассажах обнаруживают главным образом вирионы, изменившие какой-либо один генетический признак. С увеличением числа пассажей в популяции выявляют вирионы, изменившие два и более генетических признака; количество таких частиц постоянно возрастает, и в дальнейшем у подавляющего большинства вирусных частиц наблюдают изменение многих генетических признаков.

В основе механизма наследственной изменчивости вирусной популяции при пассажах лежат два процесса: мутация и селекция. В том и другом процессе важную роль играет внешняя среда, которая является одновременно индуктором мутации и селективным фактором.

Если гетерогенную вирусную популяцию, которая имеет в составе измененные и исходные вирусные частицы, культивировать в обычных условиях, то происходит ее реверсия. Например, как показали исследования с аттенуированным вирусом полиомиелита типа 3, реверсия измененных признаков может быть связана не только с гетерогенностью вирусной популяции, но и с наличием в генетически однородной популяции частиц вируса, обладающих низкой стабильностью наследственных свойств.

Накопилось большое число фактов об изменчивости вируса, вызываемой хозяином (host-controlled variation). Изменения заключаются в том, что клетка влияет на характер синтезируемых в ней компонентов вируса. Такие модификации не затрагивают нуклеотидную последовательность генома вируса. Они описаны у ДНК-содержащих бактериофагов, вируса Сендай, болезни Ньюкасла, гриппа и др. Состав белков, закодированных в геноме вируса, может модифицироваться клеткой-хозяином. Это обусловлено наличием в клетке особых мутагенных форм тРНК с нарушенным соответствием между антикодоном и кодоном соответствующей аминокислоты.

Возможны модификации, вызванные включением в вирусную частицу компонентов клетки-хозяина (главным образом белков и липидов): миксовирусы, парамиксовирусы, оболочка которых представляет собой модифицированную клеточную мембрану. Такая мембрана содержит как клеточные липиды, так и клеточные белки хозяина. Поэтому при смене клетки-хозяина (клеточной системы или вида организмов) в структуре оболочки вируса меняются и клеточные антигены.

Антигенные варианты альфавирусов и флавивирусов связаны с условиями культивирования в различных системах хозяина. Белковые компоненты клеток-хозяев включаются в суперкапсидную оболочку вириона, вызывают изменения его антигенной характеристики.

Таким образом, клетка-хозяин может существенно влиять на фенотип вируса или блокировать (частично или полностью) его репродукцию.

Последствия мутаций :

• изменение фенотипических проявлений в нормальных условиях. Например, увеличивается или уменьшается размер бляшек под агаровым гелем; увеличивается или ослабляется нейровирулентность для определенного вида животных; вирус становится более чувствительным к действию химиотерапевтического агента и т. д. Морфологические или структурные мутации могут касаться размера вириона, первичной структуры вирусных белков, изменения генов, детерминирующих ранние и поздние вирусоспецифические ферменты, обеспечивающие репродукцию вируса;
• летальная мутация, при которой нарушается синтез или функция жизненно важного вирусоспецифического белка, например вирусной полимеразы;
• условно-летальная мутация, при которой вирусоспецифический белок сохраняет свои функции в определенных, оптимальных для него условиях и теряет функции в неблагоприятных условиях. Примером таких мутаций являются температурно-чувствительные (от англ. temperature-sensitive) - ts-мутации, при которых вирус теряет способность размножаться при повышенных температурах (39-42 °С), сохраняя эту способность при обычных температурах выращивания (36-37 °С).

Отбор мутантов . При работе с измененными организмами важно изучить мутационную изменчивость того или иного вируса и отобрать интересующие мутанты. Для отбора определяют физико-химические и биологические свойства мутантов:

• связь между изменением определенного признака (маркера) и вирулентностью (реактогенности, иммуногенности и других свойств вируса) - ковариация генетических признаков у мутантов;
• природу мутантного фенотипа: способность к репродукции в той или иной системе, терморезистентность, гемагглютинирующие, гемолизирующие и другие свойства.

Поскольку в вирусологии исследуют свойства популяции в целом, то для проявления изменения наследственности вируса необходим процесс селекции, т. е. создание таких условий, при которых происходит преимущественное размножение вирусных частиц с измененной наследственностью. В результате вся вирусная популяция будет состоять из однородных генетических мутантных вирионов.

При получении генетически однородной популяции в экспериментальных исследованиях используются следующие методы селекции:

• выделение клонов из одиночных пустул на хорионаллантоисной оболочке куриного эмбриона;
• селекция клонов из бляшек на культуре клеток;
• селекция методом предельных разведений;
• селекция методом избирательной адсорбции и элюции;
• селекция методом пассажей в измененных условиях культивирования.

Для генетического анализа пригодны лишь те признаки, которые легко выявляются, достаточно стабильны и контролируются единичной мутацией. У вирусов животных такие сложные признаки, как патогенность, вирулентность, антигенная структура, контролируются не одним, а многими генами.

В настоящее время отбор мутантов вирусов животных проводится на основе анализа условно-летальных мутаций. Все условнолетальные мутанты данного класса (например, все ts-мутанты) обладают одним общим признаком и фенотипически в большинстве случаев неразличимы. Одной из причин возникновения ts-чувствительности в результате мутации является изменение первичной структуры какого-либо белка, например фермента. Причем это изменение таково, что при пермиссивной температуре фермент работает, а повышение (понижение) температуры изменяет его конформацию сильнее, чем конформацию белка дикого типа, и приводит к отсутствию ферментативной активности у мутантного белка.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .